Druga część Assassin's Creed przenosi nas z bliskiego wschodu w czasach krucjat, do włoskich miast w okresie renesansu. Będziemy mogli pozwiedzać takie miasta jak Florencja, Wenecja i Rzym. Główną postacią serii jest Desmond, który przy użyciu specjalnej maszyny – Animusa – poznaje losy swojego przodka, którym jest Ezio Auditore de Firenze, który jest asasynem. Tym samym Ezio staje się głównym bohaterem całej gry.

Twórcy gry przygotowali główny wątek fabularny oraz wiele pobocznych misji, w których będziemy musieli się skradać, wtapiać w tłum, oraz atakować odpowiednie cele. Podczas wykonywanych misji nie zabraknie niespodzianek takich jak historyczne postacie np. Leonardo da Vinci, który użyczy nam kilku swoich gadżetów.